Инженерные мыши дают человеческим мозговым органоидам пространство для формирования работающих цепей

Ученые Стэнфордской медицины добились крупного прорыва в выращивании человеческих клеток мозга вне человеческого мозга и вне лабораторного оборудования.

В исследовании, которое будет опубликовано онлайн 16 сентября в журнале Nature, исследователи успешно пересадили самоорганизующиеся фрагменты лабораторно выращенной человеческой ткани мозга, называемые корковыми органоидами, в специально биоинженерных и выведенных мышей, у которых отсутствовала почти вся их мозговая кора. (Мозговая кора — это внешний «слой» мозга, которому приписывается большая часть нашей высшей функции, такой как познание, язык, внимание и принятие решений.)

Образовавшаяся огромная полость в мозгах мышей оказалась гостеприимной средой. Человеческая ткань выжила, процветала, росла и развивала работающие связи с мозгом мышей и далее со спинным мозгом.

"Эти модели животных предоставляют уникальную возможность изучить, как связанные с болезнью изменения в цепях человеческого мозга проявляются в интактной нервной системе", сказал Сергиу Паска, доктор медицины, профессор кафедры психиатрии и поведенческих наук имени Кеннета Т. Норриса-младшего и член Нейробиологического института Ву Цая.

Исследователи были поражены тем, что обнаружили в этих мышах важный тип нервных клеток, который ранее не наблюдался в лабораторной культуре и был виден только в вскрытиях мозга человека.

Паска, являющийся директором Программы органогенеза мозга Стэнфорда имени Бонни Ойтенгсу и его семьи, исследователем CZ BioHub и научным сотрудником Института Гувера при Стэнфорде, является старшим автором исследования. Соавторство ведущих авторов разделяют постдокторант Константин Каганов, доктор философии; ассистент профессора психиатрии и поведенческих наук Кевин Келли, доктор медицины, доктор философии; инструктор нейрохирургии Тило Гшвинд, доктор философии; и студент-медик Пол Махари.

Новая методология должна ускорить исследования лежащих в основе биологических причин шизофрении, эпилепсии, глубокого аутизма и церебрального паралича, сказал Паска. "Нейробиологи смогут узнать намного больше о причинах и механизмах нарушений нейроразвития, возникающих во время беременности, и протестировать возможные вмешательства для их исправления или предотвращения."

Такие состояния исключительно сложно изучать на молекулярном и клеточном уровне, потому что мозг более сложен, чем любой другой орган, и потому что живая человеческая мозговая ткань почти всегда недоступна.

Один из 20 американских взрослых страдает от тяжелого психического заболевания; связанные с этим медицинские, социальные и экономические бремена огромны. Более чем у 1 из 100 взрослых диагностирована шизофрения, которая, как считается, в основном является результатом аномалий мозговых цепей, предшествующих рождению. Примерно 1% всех людей остаются эпилептиками на протяжении всей взрослой жизни.

По словам Элисон Сингер, президента Фонда науки об аутизме, благотворительной организации, защищающей интересы пациентов и финансирующей исследования аутизма, один из каждых 218 американских детей соответствует критериям глубокого аутизма: несомненно, инвалидизирующее состояние, требующее круглосуточного надзора для обеспечения безопасности, а также помощи в повседневной деятельности, такой как одевание, использование туалета и приготовление пищи.

"Глубоко аутичные пациенты имеют выраженные когнитивные нарушения с измеренными IQ ниже 50. Они уязвимы к нарушениям сна, эпилепсии и самоповреждениям; они чрезмерно часто проявляют агрессивное поведение", сказала она.

В своих лабораторно созданных "ксенокортикальных" мышах исследователи также смогли продемонстрировать уникальную уязвимость человеческих мозговых нервных клеток к кислородной недостаточности — известной причине церебрального паралича, который возникает при кислородном голодании во время беременности или вокруг рождения, поражая 3 из 1000 американцев и являясь фактором риска для эпилепсии и аутизма.

"Хотя модели животных были исключительно полезны, некоторые биологические особенности, похоже, уникальны для человека", сказал Паска.

Он и его коллеги обошли это ограничение через серию экстраординарных лабораторных прорывов. Более десяти лет назад они описали создание того, что теперь известно как органоиды — трехмерные лабораторные культуры, напоминающие определенные области мозга. Они преобразовали человеческие клетки кожи в стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в большинство типов клеток организма, а затем осторожно подтолкнули эти клетки к формированию самоорганизующихся скоплений мозговой ткани, внутренняя архитектура которых тесно напоминала архитектуру цепей, найденных в мозговой коре.

"Теперь мы можем генерировать широкий спектр типов клеток мозга, присутствующих во всей развивающейся человеческой нервной системе", сказал Паска.

Варианты органоидов, имитирующие различные области мозга, могут быть расположены рядом для стимуляции взаимодействия между ними и проникновения их составляющих нервных клеток или нейронов с образованием сложных сигнальных цепей, напоминающих цепи в человеческом мозге. Эти слитые комбинации мультиорганоидов, которые Паска позже назвал сборками, могли быть соединены в группы по три или даже четыре, чтобы воссоздать пути в наших телах, которые управляют движением или ощущениями.

Но были ограничения. "Мы не могли изучать сложное человеческое поведение в чашке Петри", сказал Паска. Кроме того, отсутствие кровоснабжения, инфильтрации иммунными клетками, связей с сенсорным входом и двигательным выходом, а также неполное созревание некоторых типов составляющих клеток ограничивали то, что можно было узнать, исследуя органоиды или сборки в культуре для изучения расстройств нейроразвития или общих процессов человеческого мозга.

Могла ли интеграция человеческих органоидов в мозг живого грызуна — особенно когда этот мозг находился на ранней стадии формирования цепей — решить эти ограничения?

В 2022 году Паска и его коллеги пересадили человеческие корковые органоиды в мозги новорожденных крыс и увидели гораздо лучшее развитие нейронов, чем это можно было бы достичь в чашке Петри. Пересаженные человеческие органоиды, размером примерно одну пятую дюйма (0,5 сантиметра) в диаметре при пересадке, заняли полную треть полушария мозга крысы через шесть месяцев.

В восемь месяцев отдельные нейроны из человеческих органоидов в мозгах крыс были значительно больше и электрически активнее, чем те, что находились в органоидах, созданных таким же образом в одно и то же время, которые оставались в чашке Петри вместо пересадки. Они демонстрировали гораздо более сложные паттерны ветвления. И они интегрировались со своими соседями-нейронами крыс, образуя рабочие мозговые цепи.

"Клетки, которые мы пересаживаем, несут генетический материал человека, от которого они произошли — независимо от того, является ли этот человек пациентом или здоровым человеком — позволяя нам изучать нисходящие эффекты болезни в клетках мозга и цепях", сказал Паска.

"Идея того, что вы можете создать модель органоида с уникальным генетическим характером конкретного человека и использовать это, чтобы узнать, что произошло неправильно в мозге этого человека, является критическим шагом в направлении персонализированной медицины", сказала Сингер, президент Фонда науки об аутизме.

В этом же исследовании 2022 года команда Паска засеяла корковые области новорожденных крыс мозговой тканью молодых пациентов с редким, но разрушительным генетическим состоянием, называемым синдромом Тимоти, характеризующимся тяжелым аутизмом и повышенной уязвимостью к эпилепсии и шизофрении. Паска и его коллеги смогли определить молекулярный дефект этого расстройства и позже нашли кандидатный препарат для его лечения. Этот препарат сейчас готовится к участию в испытаниях безопасности фазы 1/2.

Даже тогда были ограничения: например, нейроны крыс развивались намного быстрее, чем нейроны человека.

В новом исследовании команда Паски придумала способ исключить большую часть этой конкуренции. Они создали штамм лабораторной мыши, который был генетически модифицирован таким образом, что "стартовые клетки", которые дают начало эволюционно более недавнему дополнению мозговой коры — неокортексу — и определенным другим мозговым структурам, не могут образовываться.

Достижение этого потребовало нескольких технически сложных этапов. Но команда наконец создала мышей, которые выживали в здоровом состоянии, несмотря на отсутствие большей части их коры и гиппокампа, структуры мозга, важной для формирования памяти.

По достижении взрослости мозги "апаллиальных мышей" (названных так, потому что отсутствующая корковая ткань развивается из пренатальной структуры мозга, называемой паллиумом) содержали всего 2% эквивалентного кортикального содержимого обычных мышей, оставляя достаточно места, которое могло бы быть занято человеческими корковыми клетками.

"Наши результаты предполагают, что, когда корковая цепь теряется очень рано в развитии, кора может быть не единственной ответственной за все функции, которые традиционно ей приписываются", сказал Паска. "Другие области мозга могут компенсировать некоторую отсутствующую корковую цепь по мере развития мозга."

Хотя апаллиальные мыши с первого взгляда практически неотличимы от нормальных мышей, они все же проявляли небольшие, но измеримые поведенческие странности: немного более осторожную походку, вероятно отражающую несколько скомпрометированную мелкую моторику, и тенденцию быть более забывчивыми о недавно встреченных новых окружениях. Их поведенческая производительность также варьировалась больше от одного человека к другому, чем у нормальных контрольных мышей, что предполагает, что кора имеет стабилизирующую роль в функции мозга.

Новорожденные апаллиальные мыши служили получателями человеческих органоидов мозговой коры. Примерно через два месяца развития органоидов коры (полученных от здоровых доноров, которые дали согласие на пересадку своих клеток животным), исследователи хирургически поместили органоиды (обычно по одному на каждого получателя), содержащие примерно 100 000 клеток каждый, в увеличенные полости, наполненные жидкостью, в мозгах 2-дневных апаллиальных животных.

Великое большинство этих операций прошли успешно. Человеческая ткань выжила и процветала в мозгах мышей с истощенной корой. Через три месяца после операции более 90% по объему корковой ткани в мозгах мышей была человеческой. Интеграция человеческих и мышиных нейронов в цепи быстро прогрессировала.

Через три-шесть месяцев после операции пересадки производительность ксеноцитокальных мышей в тестах поведения была в целом схожа с производительностью их сверстников-пиров обычного размера.

В эксперименте с доказательством концепции, демонстрирующем, как эти мыши можно использовать для изучения болезней, ксеноцитокальные мыши подвергались пятичасовому воздействию низкого уровня кислорода. Воздействие нанесло существенный ущерб их человеческой корковой ткани. Ксеноцитокальные мыши, лишенные кислорода, казались, испытывали трудности с поддержанием устойчивой походки и сохранением равновесия, напоминающим то, что наблюдается у детей с церебральным параличом. В отличие от нормальных и апаллиальных мышей они почти не пострадали.

"Выяснение того, что объясняет эту разницу, может пролить свет на уязвимость человеческих нейронов к кислородной недостаточности, осветить механизмы, лежащие в основе церебрального паралича, и предоставить платформу для тестирования потенциальных терапевтических стратегий", сказал Паска.

Замечательно, что человеческая мозговая ткань ксеноцитокальных мышей содержала обнаруживаемые количества того, что исследователи определили как нейроны фон Экономо, или VEN. Эти нервные клетки странны несколькими способами: они ранее наблюдались только в посмертной мозговой ткани, ранее не были созданы в культуре и не появлялись в более ранних экспериментах по пересадке в более переполненных условиях в мозгах животных-получателей. Они очень редки, составляя примерно один из каждых 90 000 корковых нейронов.

Оно было первоначально считались специфичными для человека, они теперь, как известно, присутствуют у других крупномозговых, высокосоциальных животных, включая больших обезьян, слонов, дельфинов и китов. У людей они расположены в лобно-инсулярной коре и передней поясной коре, двух областях мозга, задействованных в социальной осведомленности и принятии решений. Их проекции могут распространяться далеко за пределы этих корковых центров. Они гигантские — намного больше, чем большинство других нейронов — и отчетливо сигаровидной формы.